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多杀性巴氏杆菌主要毒力因子最新研究
摘 要： 多杀性巴氏杆菌(Pm)是一种有荚膜的革兰阴性球杆状兼性厌氧菌,包括5个荚膜血清型,16个脂多糖血清型,属于多种动物上呼吸道共生微生物。Pm一般不引起疾病,但在动物营养不良和抵抗力下降时,它可以直接或间接的导致某些动物性疾病,如家禽的禽霍乱、猪的萎缩性鼻炎和牛的呼吸道疾病等。这些疾病的高发病率和死亡率严重影响畜牧业发展,同时人类也可通过和动物接触而感染致病,因此研究影响该菌毒力的因素进而研发出相关的疫苗十分重要。论文对Pm主要毒力因子的研究进展进行综合阐述,以期为多杀性巴氏杆菌相关疾病的防控提供参考。
关键词： 多杀性巴氏杆菌; 毒力因子; 疫苗;
Abstract： Pasteurella multocida(Pm) is a capsulated Gram-negative globular anaerobic bacterium,including 5 capsular serotypes,16 lipopolysaccharide serotypes,and which belongs to symbiotic microorganism in upper respiratory tracts of various animals.Pm generally do not cause disease,but when animal malnutrition and resistance decline,it could directly or indirectly cause certain animal diseases,such as fowl cholera in poultry,atrophic rhinitis in pigs,bovine respiratory disease,etc.The high morbidity and mortality of these diseases seriously affect the development of animal husbandry,and humans can also be infected by contacting with animals.Therefore,it is important to study the virulent factors of Pm for developing related vaccines.This paper comprehensively expounded the research progress of Pm main virulence factors,in order to provide reference for the prevention and control of Pasteurella multocida related diseases.
Keyword： Pasteurella multocida; virulence factor; vaccine;
多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)在血琼脂上生长良好,麦康凯琼脂培养基上不生长,是广泛存在于动物口腔、鼻咽和上呼吸道的正常微生物群,一般不引发疾病,但动物抵抗力下降会出现暴发性感染,进而引发各种动物性疾病,同时该菌也可感染人类,调查发现,全球每年因巴氏杆菌病死亡的人数正在增加,幼儿、老人和免疫功能缺陷的人与动物接触后,最易出现蜂窝组织炎和淋巴炎,有时并发脓肿形成。科学家发现从人和猫体内分离的Pm毒力基因和耐药性相似,说明猫可以作为该菌的潜在携带者和传播者,因此平时需加强对宠物Pm的防控[1,2]。Pm的致病性与荚膜等多种毒力因子有关,这些毒力因子通过破坏宿主组织和防御系统并激发炎症反应来促进该菌侵袭和定殖。
1 、荚膜
荚膜是物质进出细菌的必经通道,可抵抗干燥,促进黏附定殖,躲避宿主的吞噬和补体介导的杀伤作用,增强细菌对宿主的适应性,根据荚膜结构的差异,Pm分为5个血清型(A、B、D、E和F)[3]。Wilson B A等[4]发现A、D和F型荚膜生物合成基因座彼此高度相似。还有某些毒力因子和荚膜类型有关,如皮肤坏死毒素(Pasteurella multocida toxin,PMT)toxA基因和荚膜D型相关。有研究者发现动物疾病与荚膜类型也有关联,如猪萎缩性鼻炎(Atrophic rhinitis,AR)是由D型和某些A型Pm产生的PMT引起的疾病,有研究者对我国12个省市24个养殖场猪进行调查发现其全部发生AR,该病严重影响了养猪业发展。禽霍乱(fowl cholera,FC)是一种主要由A∶1、A∶3和A∶4引起的全身性疾病,但也有从患FC的鸡体内检测出F和D型的报道[5,6]。荚膜F型Pm通常在禽类中存在,猪中少见,但有学者从我国猪的临床样本中分离出F型菌株,并分别感染鸡和猪,结果显示该菌株对鸡基本无毒,对猪高致病,并首次确定了猪F型分离株的完整基因组序列[7]。
与有荚膜的野生型菌株相比,荚膜缺失菌株毒力下降甚至丧失,但恢复荚膜的互补菌株毒力和野生型菌株相当,这充分说明荚膜与Pm毒力表达有关。有报道称荚膜缺失菌株形成的生物膜比荚膜菌株产生的更厚、更光滑,证明荚膜可影响生物膜的形成,进一步影响Pm对宿主的黏附定殖[8]。目前,发现多种因素可影响该菌荚膜从而影响其毒力,有报道称禽Pm A型菌株39 ku蛋白质的量和荚膜厚度相关,39 ku蛋白质的量越大荚膜越厚,相应的细菌毒性也越强。Peng Z等[9]发现HB01基因组中的岛状片段与荚膜生物合成和输出有关。Fis蛋白表达障碍的Pm荚膜产量下降使该菌毒力减弱,证实Fis蛋白可促进Pm荚膜生成。与野生型亲本菌株相比,Pm RNA结合伴侣蛋白Hfq突变株合成的透明质酸荚膜减少,该菌的毒力、生长速度下降,说明Hfq在Pm生长中发挥重要作用。
2 、脂多糖
脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是一种保护性抗原,有助于Pm黏附定殖,躲避宿主先天免疫,它通常包含4个区域,即脂质A、内核、外核和O-抗原,Pm LPS不含O-抗原,因此该菌LPS的可变成分是最远端的外核,完整的外核结构有助于菌株表现出完全毒力[10]。研究者利用waaQPM基因的插入失活构建的Pm突变株LPS被严重截短,且不能引起鸡FC,对该突变株补充功能性waaQPM基因后LPS恢复至全长,同时细菌恢复致病性,说明waaQPM对Pm LPS的结构和致病性很重要。并且,有学者发现LPS中的庚糖基转移酶hptA也会影响Pm的毒力。LPS上的磷酸胆碱PCho对Pm的生长和毒力表达至关重要,缺乏Pcho将导致LPS变短,从而增加Pm对抗菌肽fowlicidin-1的敏感性,可见LPS结构的细小变化也会对Pm产生巨大的影响[11]。
3 、外膜蛋白
外膜蛋白(outer membrane proteins,OMP)参与菌体营养摄取过程,分子进出细胞的传递,宿主的定殖和侵袭,宿主免疫反应的逃避,宿主组织的损伤等,是良好的免疫原,对细菌存活非常重要。其中双结构域蛋白OmpA可作为黏附素和宿主细胞外基质蛋白结合,有助于Pm的黏附定殖,其C末端与肽聚糖的相互作用可稳定细胞膜结构[12]。外膜孔蛋白OmpH可通过刺激先天免疫细胞影响细胞因子的分泌,通过调节荚膜的产生来影响Pm的致病性。Varinrak T等[13]发现反义-OmpH RNA转录的Pm荚膜变薄,毒性减弱,并且可以诱导针对禽多杀性巴氏杆菌菌株的充分保护,可见OmpH可影响该菌荚膜形成并进一步影响细菌毒力。外膜蛋白PlpE虽然不是Pm必需的毒力因子,但它是一种对该菌非常重要的交叉保护性抗原。
4、 黏附素
帮助Pm黏附在宿主表面上皮细胞的毒力因子有Flp菌毛和ptfA基因编码的Ⅳ型菌毛等,它们在Pm生物膜形成、定殖和发病机制中起关键作用,其中Ⅳ型菌毛具有黏附作用,能使细菌牢固地附着于动物消化道、呼吸道和泌尿生殖道的黏膜上皮细胞上,已成功用作Pm疫苗[14]。目前已知的黏附素蛋白质有OmpA、转铁蛋白结合蛋白Tbp和推定的TonB受体HgbA等。
Pm中编码丝状血凝素(filamentous hemagglutmin,FHA)的毒力基因FhaB1和FhaB2(又称PfhB1和PfhB2)和荚膜一样能增强细菌对宿主环境的适应能力。试验中Pm fhaB2突变株在火鸡静脉内感染时,毒力适当减弱,而鼻内感染时高度减毒,推测fhaB2基因与呼吸道黏膜表面的定殖或侵袭有关,且该突变株与亲本菌株对血清补体介导的杀伤作用具有同等抗性。
5、 皮肤坏死毒素
皮肤坏死毒素(Pasteurella multocida toxin,PMT)是一种高效的促有丝分裂原,可阻止细胞凋亡,诱导肌动蛋白细胞骨架的重排,在自然感染中限制适应性免疫应答,PMT通过遏制成骨细胞的分化促进破骨细胞的生成引起AR,患病猪生长速度和饲料利用率下降给养殖业带来巨大的经济损失[15,16]。PMT先激活Gαq/11,然后p63RhoGEF辅助Gαq/11激活RhoA,同时p63RhoGEF和Gαq/11相互作用,活化的RhoA通过Rho激酶反式激活促分裂原活化蛋白激酶级联反应,来抑制成骨细胞的分化。并且,学者发现PMT能通过影响成骨细胞转录因子来抑制该细胞生成,已知它对晚期转录因子SP7的影响比对早期转录因子RUNX2大。Wilson B A等[4]还发现PMT可通过调节信号传导来使哺乳动物细胞致病。
6 、铁调节外膜蛋白
铁是所有病原体的必需元素,细菌吸收铁离子后能更好地适应不断变化的环境,并可能在Pm从共生过渡到致病状态中发挥重要作用,在缺铁或铁富足的环境下Pm中受铁含量影响的外膜蛋白被称为铁调节外膜蛋白(iron regulatory the outer membrane protein,IROMP),hgbA、hgbB蛋白能将氯化高铁血红素作为铁源来帮助细菌获取铁,已知TbpA与hgbB基因控制Pm的铁摄取,TonB-ExbB-ExbD复合物组成的TonB系统转移转运铁所需的能量,在铁的物理转运过程中TonB蛋白充当能量转换器,铁穿过外膜时,ExbB与ExbD蛋白使TonB稳定[17]。Wilson B A等[4]指出铁采集系统可限制宿主特异性,如牛病原体溶血性巴氏杆菌具有转铁蛋白结合受体,只结合牛转铁蛋白,而不与猪或人转铁蛋白结合。
7、 唾液酸酶
唾液酸酶是由多杀性巴氏杆菌产生的细胞外糖酵解酶,可修饰脂寡糖(lipooligosaccharide,LOS),未唾液酸化的Pm细胞极易被宿主识别清除,虽然Pm无法从头合成唾液酸,但能产生唾液酸酶用于从宿主糖基化蛋白质和脂质中获取唾液酸作为自身的碳源,该酶可暴露主要的宿主受体或降低宿主防御来增强细菌毒力,使细菌获得黏附和侵入宿主细胞的能力,同时该酶还可为菌体生长提供营养。nanH和nanB两个唾液酸酶均具有高pH耐受性,以在不同的宿主细胞区室发挥作用。虽然唾液酸代谢在毒力中的作用一直存在争议,但有研究表明唾液酸酶nanP和nanU基因突变体在火鸡体内致病性显着降低,说明在火鸡中,Pm吸收和掺入唾液酸的能力是其获取毒力的必要条件。
8、 其他调节因子
生长依赖型类核相关蛋白Fis可调控Pm荚膜形成,FHA PfhB2、外膜蛋白PlpE、铁调节蛋白exbB和LPS pm1042基因等。Pm Hfq突变株的荚膜和FHA形成减少,从而进一步影响该菌的毒力,Hfq与Fis均能在转录水平上调节荚膜的表达,并且Fis对Hfq的调节有促进作用[18]。
郭东春等[19]发现Pm aroA基因突变株在小鼠体内致病性明显减弱,而aroA基因主要控制芳香族氨基酸的形成,推测此氨基酸可能与该菌毒力表达相关。PhoP和PhoQ基因修饰LPS或OMPs可帮助细菌应对极端环境,同时它们组成的双组分系统能感知外部信号并在细菌毒力中发挥重要作用。原核转录因子crp已被证明可根据细胞内cAMP浓度变化控制必需毒力因子的表达,研究发现crp的缺失会减弱Pm的毒力,从而抑制细菌生长。
Peng Z等[9]发现牛A型Pm HB01基因组含有编码Flp菌毛的tad基因位点,编码Ⅳ型菌毛的ptfA基因,编码唾液酸酶的基因和调节LPS合成的基因等,从而间接的影响Pm毒力。有研究发现饲料中适量的L-谷氨酰胺可增加Pm细菌负荷和毒力因子表达,但过量又会影响动物某些器官的功能,可见如果要用于临床实践,合适的时间、剂量和补充方法等都还需进一步研究。
9、 展望
目前,主要通过抗生素治疗和疫苗预防来对抗Pm,但滥用抗菌药会导致耐药菌的出现,通常人类感染Pm几率较低,所以现阶段主要是研究控制动物相关疫病的疫苗。有研究证明减毒活疫苗比灭活疫苗更有效,前者可提供广泛保护,后者只对具有相同或相似表面LPS结构的其他菌株提供保护[10]。目前已经确定了一些Pm疫苗候选物,如OmpH的单克隆抗体能保护小鼠免于同源和鸡免受异源感染,而小鼠和鸡中的可溶性和不可溶性PlpE都能避免异源感染[20]。用丙氨酸代替1 164位的丝氨酸和用丝氨酸取代1 165位的半胱氨酸产生的转基因PMT可作为AR的候选疫苗,该疫苗完全丧失了PMT的毒性又保留了猪诱导保护性免疫的能力。Gong Q等[21]发现将壳聚糖添加到Pm疫苗中可增强该疫苗的免疫应答,有助于更好的对抗Pm。常超越等[22]发现鸡源Pm对五味子、黄连、石榴皮和乌梅4种中草药极度敏感,说明这4种药物可作为防治鸡Pm的中草药复方制剂做进一步的研究。王斐等[23]发现重组TbpA免疫小鼠后,其血清中抗重组TbpA蛋白的IgG抗体显着升高,并且70%的小鼠可抵抗Pm感染,结果表明TbpA可作为Pm的免疫原性蛋白。伍小松等[24]发现猪Pm重组甲硫氨酸转运体Q(recombinant methionine transporter Q,rMetQ)免疫小鼠后其血清中IgG抗体明显高于对照组,在感染Pm 3 d后小鼠存活率达80%,7 d后存活率40%,结果表明Pm rMetQ皮下免疫注射可诱导小鼠产生免疫应答和较高的抗感染免疫保护力。前人的这些发现为以后的疫苗研发提供了重要的参考资料,有助于我们研发出更好更有效的疫苗,帮助畜牧业和宠物业更好的发展。
目前我国养殖规模不断扩大,养宠物的人也越来越多,人类和动物接触机会增多,而这种接触可能会导致Pm感染从良性到灾难性的变化,给人类健康和养殖业经济造成巨大的损害,因此,未来应进行更多与Pm动物疾病相关的分离株试验,更深入的了解Pm发病机制和免疫机制,以期望获得治疗相关疾病和研制更安全有效的疫苗的线索。
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